關(guān)鍵詞:免疫熒光(IF)技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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免疫熒光(IF)技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測定含量。
細(xì)胞準(zhǔn)備
用于免疫熒光實驗的細(xì)胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細(xì)胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細(xì)胞或者是將取自體內(nèi)的組織細(xì)胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細(xì)胞一般在培養(yǎng)時直接放入coverslips讓細(xì)胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實驗，以免后續(xù)的漂洗操作引起細(xì)胞脫落。少數(shù)實驗需要使用這類細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察，建議使用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
基本實驗步驟：
（1）細(xì)胞準(zhǔn)備：對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
（2）固定：根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
（3）通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
（4）封閉：使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉，時間一般為30min.
（5）一抗結(jié)合：室溫孵育1h或者4℃。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
（6）二抗結(jié)合：間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
（7）封片及檢測：滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
注意事項：
1、染完之后沒有封片前直接照一些，因為有的時候可能封片會出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時間，熒光會崔滅的。
2、熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時間仍然能照出很好的片子。
3、二抗用之前一定離心，不然有的時候有那種沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點，非常難看。
4、整個操作在4℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。
5、洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。
6、加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。
7、細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色?？勾銣鐒┛赡脕碇苯臃馄?20微升即可，之后片子可保留更長時間。
常見熒光素的特性：
1、FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。
2、RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595~600nm，橘紅色熒光。
3、TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。
4、鑭系：Eu、Tb
5、PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。
6、其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。