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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 引物合成是通過測定引物的OD值，溶解引物，*終合成引物的一個完善的過程。引物合成
引物合成
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。
引物合成特點
1.引物合成的純度高。
2.合成的序列長。
3.合成的效果好。
合成過程:
**步是將預(yù)先連接在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸反應(yīng)，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基。
**步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在后續(xù)環(huán)節(jié)根據(jù)實驗需要來選擇純化方式分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
引物純化方式:
1.C18柱脫鹽:有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。這種方法一般不會對普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。
2.OPC純化: OPC純化是根據(jù)DNA保護基(DMTr基)和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進(jìn)行純化目的DNA片段。
3.PAGE純:PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。
4.HPLC純化:HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進(jìn)行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。
引物的OD數(shù)的定量:
用紫外分光光度計，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度*好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。