關鍵詞:原核表達技術服務|實驗技術服務
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原核表達技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產(chǎn)品品牌：原核表達技術服務|實驗技術服務   http://m.prestige-ib.cn/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序實驗流程：
實驗方案 
1.  外源基因的誘導表達
（1 ）用適當?shù)南拗菩詢惹泻怂崦赶d體DNA 和目的基因。
（2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉化到相應的宿主菌。
（3 ）篩選出含重組子的轉化菌落，提取質粒DNA 作限制性內切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，確定無誤后進行下一步。
（4 ）如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時，使培養(yǎng)液的OD600達0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5 h ；如果表達載體的原核啟動子為tac 等，則37 ℃培養(yǎng)細菌數(shù)小時達到對數(shù)生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5 h 。
(5 ）取上述培養(yǎng)液1 ml，1 000 g 離心，1 min，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。
2.  大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化
（1 ）細菌的裂解
常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應用，后三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。
a.  酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。
主要步驟為：
① 4 ℃ ，5 000 rpm 離心，15 min ，收集誘導表達的細菌培養(yǎng)液（100 ml ）。棄上清，約每克濕菌加3 ml 裂解緩沖液，懸浮沉淀。
② 每克菌加8 μL PMSF 及80μL 溶菌酶，攪拌20 min ；邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進行）。
③ 37 ℃ ，玻棒攪拌，溶液變得粘稠時加每克菌20μL DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。
b.  超聲破碎法。聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎，在處理少量樣品時操作簡便，液體量損失較少，同時還可對染色體DNA 進行剪切，大大降低液體的粘稠度。
① 收集1 L 誘導表達的工程菌，40 ℃ ，5 000 rpm 離心，15 min ；棄上清，約每克濕菌加3 mlTE 緩沖液。
② 按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進行破菌；10 000 g 離心，15 min ，分別收集上清液和沉淀。
③ 分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2× 凝膠電泳加樣緩沖液，進行SDS -PAGE 。
注意事項：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度、菌種類型等因素有關，應根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標本經(jīng)3 -4 次凍溶后更容易破碎。