關(guān)鍵詞:真核表達技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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真核表達技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點：
①從結(jié)構(gòu)上看，該質(zhì)粒具有很強的復制能力，可以滿足隨宿主細胞分裂時跟隨胞質(zhì)遺傳給新生的子細胞，這（圖）真核細胞表達載體
真核細胞表達載體
是保證目的基因穩(wěn)定表達的因素之一；
②含有高效的功能強大的啟動子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細胞中穩(wěn)定表達；
③具有多克隆位點，便于目的基因的插入；
④該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細胞。
綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因來源于Jellyfish Aequorea Victoria， 是Shimomura等于1962年發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，由238個氨基酸組成，分子量約為27Kd。GFPGFP在包括熱、極端PH和化學變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定，用甲醛固定后會持續(xù)發(fā)出熒光，但在還原環(huán)境下熒光會很快熄滅。
與以往常用的報告基因相比，GFP具有以下優(yōu)點：
①在熒光顯微鏡下，用波長約490 nm的紫外線激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測；
②無需任何的作用底物或共作用物,檢測的靈敏度不受反應(yīng)效率的影響，保證了極高的檢出率；
③蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定；
④可在多種異源生物中表達且無細胞毒性；
⑤其基因片段長度較小(約717 bp)，易于構(gòu)建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性，為研究其他基因表達產(chǎn)物的分布提供了方便。EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，使其產(chǎn)生的熒光較普通GFP強35倍，大大增強了其報告基因的敏感度。EGFP與其他蛋白的融合表達已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影響其發(fā)光。
首先也是*重要的的載體的酶切，載體是否沒切好很關(guān)鍵。
1.如果有已經(jīng)構(gòu)建好的PCDNA-A，讓然要和需要的酶切位點一致，直接把這個重組載體用xhol1和Ecorl 1酶切，然后*好CIP（去磷酸化），連接的時候要做自連對照
2.PCDNA載體直接用xhol1和Ecorl 1酶切，酶切后要和未酶切的載體一起跑膠，看一下是否切開
3.查看下PCDNA質(zhì)粒圖譜，看下酶切位點的上下游和你的目的基因設(shè)計的引物酶切位點的上下游是否一致
4.做連接的時候要做對照.
5.可以用其他載體用同樣的酶切，比如pet-28a，看能否連上目的基因，以此檢驗目的基因是否切好.