關(guān)鍵詞:總RNA提取|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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總RNA提取|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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產(chǎn)品品牌：總RNA提取|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://m.prestige-ib.cn/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
（一）細(xì)胞總RNA的提取 
1、6孔板細(xì)胞匯合度為90-100%時(shí)，取出無(wú)菌室，去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑 1 ml，搖勻，無(wú)菌罩內(nèi)消化3-5 min。
2、將各孔內(nèi)消化好的細(xì)胞裂解液吸到一DEPC處理過(guò)的1.5 ml EP管中，加新開(kāi)的氯仿0.2 ml，輕搖15 s。
3、室溫靜置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，離心。然后取上清無(wú)色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過(guò)），加0.5 ml新開(kāi)的異丙醇，室溫下靜置10 min。
4、12000 rpm，10 min，4 ℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清，75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃離心。
5、去上清，點(diǎn)離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10 min， DEPC處理水20-30 μl加入，中槍打勻，55-60 ℃水浴10 min溶解總RNA，測(cè)OD值。
6、電泳。
（二）從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1、取上述提取的總RNA若干（少于0.25 mg）到一個(gè)新的無(wú)RNase 的EP管中，用無(wú)RNase的水定容到250 μl。
2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打勻或用手彈勻。
3、70℃水浴，3 min（裂解RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)）。
4、20-30℃條件下，靜置10 min（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。
5、高速離心2 min，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50 μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400 μl重懸含Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀，然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1 min。
7、將SPIN柱子移到一個(gè)新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速離心1 min，丟掉濾過(guò)液。
8、將SPIN柱子移到一個(gè)新的EP管上，加20-100 μl熱的（70 ℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip來(lái)回吸打3-4 次，高速離心1 min。
9、為保證*大的 mRNA產(chǎn)量，可再次重復(fù)第8步。
10、電泳。