關鍵詞:RNAi質(zhì)粒載體構(gòu)建|實驗技術服務
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RNAi質(zhì)粒載體構(gòu)建|實驗技術服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時，我們也會提供相應的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費精力重復實驗。另一方面，我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復我們的實驗結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：RNAi質(zhì)粒載體構(gòu)建|實驗技術服務   http://m.prestige-ib.cn/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達,誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型, 稱為RNA干擾（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以序列同源互補的mRNA為靶目標,降解特定的mRNA.RNAi的發(fā)現(xiàn)具有劃時代的意義,它不僅深入揭示 了細胞內(nèi)基因沉默的機制,而且它還是后基因組時代基因功能分析的有力工具,極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程.現(xiàn)在越來越多的研究人員開始采用RNAi 來研究生物體的基因表達.RNAi技術可廣泛應用到包括功能基因組學,藥物靶點篩選,細胞信號傳導通路分析,疾病治療等等.
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括：
·化學合成
·體外轉(zhuǎn)錄
·長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
·siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
·PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
獲得高純度的siRNA產(chǎn)物是進行實驗的**步,而轉(zhuǎn)染的效率則是非常關鍵的因素.
RNAi表達載體的構(gòu)建
1. 目的基因的確定
2、設計siRNA靶序列
在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列.研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細胞,*有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物,比較有效的是長片段dsRNA.siRNA的序列專一性要求非常嚴謹,與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果.
（1）、選擇siRNA靶位點：
從轉(zhuǎn)錄AUG起始密碼子開始,搜尋下游AA序列,記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點.有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效. Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions,UTRs),原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域,而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復合物結(jié) 合mRNA從而影響siRNA的效果.
（2）、序列同源性分析:
將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫（人,或者小鼠,大鼠等等）進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列.例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標序列進行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚,可能是位置效應的結(jié)果,因此對于一個目的基因,一般要選擇3-5個靶位點來設計siRNA.