關鍵詞:細胞永生化技術服務|實驗技術服務
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細胞永生化技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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產品品牌：細胞永生化技術服務|實驗技術服務   http://m.prestige-ib.cn/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序實驗流程：
實驗步驟：
1.  EB病毒液的制備
?  復蘇B95.8細胞株，使用培養(yǎng)基為10% FCS RPMI-1640
?  逐步添加培養(yǎng)基至細胞長至對數生長期
?  細胞計數，調節(jié)細胞數量為1×10^6個/ml
?  在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)續(xù)培養(yǎng)10天，中間不換液
?  至第10天收集培養(yǎng)上清，1800rpm，4℃離心15分鐘
?  0.22μm濾器過濾，1ml/支分裝，凍存于液氮備用
2.  病人外周血液的采集、分離
①  取病人外周血4ml+4mlBSS，混勻
②  各取4ml緩慢加入含有3ml淋巴細胞分離液Ficoll PLUS-Paque（GE Healthcare Bio-Sciences貨號:71716700,使用前，充分混勻）的10ml離心管中（分兩管進行）
③  400g，18℃，離心30min
④  小心吸取上層血漿，保存?zhèn)溆?，避免擾動細胞。
⑤  小心吸取淋巴細胞層至新的15ml離心管中
⑥  加入6mlBSS，以吸管輕輕重懸細胞
⑦  100g，18℃，離心10min，棄上清
⑧  以8mlBSS再次洗滌一遍，離心，棄上清（重懸同時進行細胞計數）
(一般1ml血能分離出1×10^6個細胞，故4ml血約有4×10^6個細胞)
3.  EB病毒轉化淋巴細胞
①  取EBV上清1ml重懸上述細胞，37℃水浴，2h，20min晃動一次
②  加入3ml 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A （環(huán)孢素A Sigma Product No. C1832 ）
③  分兩孔，2ml/孔加至24孔板中（如果分離的血量大，請酌情考慮加入25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)），37℃，5％CO2培養(yǎng)
④  一般24h后即可見到細胞聚集成團生長，3-5天可見液體PH值發(fā)生變化，呈橙黃色，早期視情況補液，待細胞生長良好再采用半量換液（培養(yǎng)基為 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A）
⑤  一般15天左右即可建立穩(wěn)定生長的淋巴母細胞。
經驗總結及注意事項：
環(huán)孢素A容易吸附在容器上，請配成高濃度貯液，工作液盡量現配現用。
EB病毒液請按照上述方法制備，保證高的病毒滴度，不可4℃存放?。?！
外周血盡量新鮮采集，并保證無菌，推薦使用枸櫞酸鈉抗凝管?。?！
進行EB病毒感染永生化的細胞不要少于1×10^6，少于該數會影響成功率。